流式細胞術(shù)疑難解答

更新時(shí)間:2021-12-11 熱度:°

信號弱

如果抗體染色信號弱或無(wú)信號,可能是由于以下原因引起的:

1、抗體儲存

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確保你的抗體保存在4℃并且避光。如果抗體結合了熒光素,那么千萬(wàn)不要冷凍保存,因為這可能會(huì )導致熒光抗體的沉淀和聚集。還有,要確??贵w沒(méi)有過(guò)期。

 

2、稀釋

你是不是一直在用廠(chǎng)家推薦的量做實(shí)驗?你可能需要進(jìn)行抗體滴定找到最佳抗體用量。

詳見(jiàn):

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2484-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-42-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1755-1-1.html

 

3、儀器--濾光片設置

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確保流式機器配置有合適的、能夠檢測到你所用熒光的激光和濾光片。例如Brilliant Violet™ 570需要紫光激光器和585/42的濾光片,如果你用了525/50濾光片,那么就檢測不到信號了。

不同熒光有不同的發(fā)射譜,為了檢測到信號,需要配置有能夠捕捉到該波長(cháng)信號的濾光片。在上面的例子中,525/50濾光片只能捕捉500~550nm的信號,而B(niǎo)V570的峰值波長(cháng)在570nm,超出了范圍,故無(wú)法被該濾光片檢測到。

還有需要了解每根激光有多少個(gè)光電倍增管(PMT),如果紫光激光器只有3個(gè)PMT,那么你想檢測4色就不可能了。

 

4、儀器--激光性能

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如果流式細胞儀的激光沒(méi)有很好的校準,那么就可能導致某些通道(或所有通道)信號弱。使用一些校準微球可以很方便地檢查儀器性能。所以記得按照流式細胞儀廠(chǎng)家的指導定期進(jìn)行質(zhì)量控制和優(yōu)化檢查。

 

 

5、抗原表達--表達密度

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某些抗原本身就表達非常弱,或者只有非常少的細胞群體表達,此時(shí),表達弱就是正常的??梢試L試選擇強的熒光素或選擇SI值高的抗體(參見(jiàn):http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4167-1-1.html)

 

6、抗原表達--細胞特異性

 

有些單倍型特異性標記只表達在某些系別的小鼠上,所以購買(mǎi)抗體前需要詳細閱讀抗體說(shuō)明。例如小鼠H-2K、I-A、CD90和CD45。

而且,流式細胞術(shù)基于逐級設門(mén),如果門(mén)一開(kāi)始設錯了,也可能影響最后的分析結果,導致假性弱表達。

 

7、抗原表達--表達位置

 

要知道,有些抗原表達在細胞表面、有些表達在胞漿、細胞器內、胞核,甚至有些所有部位都表達。所以需要采用合適的方法學(xué)去檢測。

 

8、抗原表達--誘導

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有些抗原在活化后發(fā)生下調,而有些標記和細胞因子則需要誘導才能表達(參見(jiàn):http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-716-1-1.html),如果你不經(jīng)過(guò)誘導就檢測這些標記或細胞因子,就會(huì )出問(wèn)題。

 

9、緩沖液

你實(shí)驗使用的緩沖液是否正確?例如Biolegend的FoxP3在他們自家的foxP3緩沖液中性能良好,但如果換了其它家的緩沖液,可能就檢測不出來(lái)了。同樣,其它廠(chǎng)家大多也是如此。固定和破膜緩沖液也十分重要。

 

10、二抗

 

如果你一抗用了純化或生物素標記的抗體,那么二抗是否用了正確的抗體?例如一抗用了Rat Anti-mouse,那么你的二抗應該用Goat Anti-Rat,同時(shí)應該用只加二抗的管子作為空白對照檢測背景熒光。

還有,你應該檢測一下二抗是否還會(huì )跟其它一抗發(fā)生反應,這有助于發(fā)現是一抗還是二抗的問(wèn)題。

 

 

11、固定

你是否在染色前固定或破膜了?固定和破膜能夠改變抗原表位和抗體的相互作用,這種敏感性是抗原依賴(lài)性和克隆依賴(lài)性的。例如HIT2 (human CD38), 5C3 (human CD40), BC96 (human CD25)這幾個(gè)表位通常在去污劑或甲醇處理后是不穩定的。而有些抗原位點(diǎn)則需要固定后才能與抗體結合而被檢測到,例如核內抗原PCNA和Ki67。

此外,固定時(shí)間不能太長(cháng),否則容易導致交聯(lián)反應而影響熒光素的化學(xué)特性或增加自發(fā)熒光。

 

 

12、貼壁細胞和受體

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如果你在檢測貼壁細胞,使用的是胰酶消化,那么需要注意胰酶可能會(huì )影響一些表面標記的表達。類(lèi)似的現象也會(huì )發(fā)生在膠原酶消化后。

 

13、噪音和背景信號

PMT的背景信號和噪音高也會(huì )導致信號弱,這可能是由于激光源的散射光、其它熒光素的滲漏或自發(fā)熒光過(guò)強等原因引起。

 

14、熒光滲漏

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熒光滲漏是多色流式時(shí)檢測信號出問(wèn)題最常見(jiàn)的問(wèn)題所在。所以,正確的補償非常重要。

關(guān)于補償,請參見(jiàn)帖子:

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3523-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2191-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-20-1-1.html

https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-396-1-1.html

 

 

 

 

背景熒光強/非特異性染色明顯

背景熒光高(即非特異性染色明顯)可能是多種因素造成,例如熒光素、抗體、標記方法、儀器、其它試劑或數據分析等。在此,我們對這些因素進(jìn)行一一解析,讓大家能夠充分了解背景熒光的來(lái)源,從而能夠在實(shí)驗中針對性的去解決。

 

1、自發(fā)熒光

不同細胞和組織,以及培養基添加物,都有不同水平的自發(fā)熒光。自發(fā)熒光主要的來(lái)源包括NADH、核黃素、黃素輔酶分子、多聚甲醛中的伯胺分子交聯(lián)、某種生物結構(如線(xiàn)粒體、溶酶體等)。粒系細胞特別容易出現自發(fā)熒光,因為這些細胞內的蛋白和分子更容易在低波長(cháng)時(shí)被激發(fā)(例如紫外、紫光和藍光),發(fā)射波長(cháng)大約在500~700nm,與一些常見(jiàn)的熒光素(如FITC、PE)重疊。所以對這類(lèi)細胞應該記得用未染色的空白對照檢查一下自發(fā)熒光水平。

 

另外切記,直方圖上看不出自發(fā)熒光群,只有通過(guò)散點(diǎn)圖才能看出自發(fā)熒光群體并將它圈出,如下圖中所示FL-1(GFP)和FL-2散點(diǎn)圖查看GFP表達細胞,直方圖看到兩個(gè)峰,但無(wú)法區分自發(fā)熒光,而散點(diǎn)圖則可輕松圈出自發(fā)熒光群體(AF)。

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2、稀釋

抗體用量是否合適?盡管廠(chǎng)家會(huì )有推薦的抗體用量,但要記得使用前進(jìn)行抗體滴定,以了解最佳用量。優(yōu)化后的抗體用量可以幫助你最大程度地減少背景熒光并提高信噪比。

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3、補償高

如果兩個(gè)或更多的熒光素之間發(fā)射譜重疊,那么就需要調節補償以消除相互間的影響。不過(guò),調節補償前,首先需要電壓值調節到合適的值,否則會(huì )導致補償異常增大。例如下圖中,BV510™和BV570™之間由于相互滲漏存在補償,如果BV570™的電壓被BV510™的電壓明顯高,那么會(huì )導致補償過(guò)大(下圖左側),如果PMT電壓調節到合適值,那么他們的補償就非常好調了(下圖右側)。

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所以,有時(shí)候你的背景熒光高很可能是由于電壓沒(méi)有調好的問(wèn)題。

 

4、代謝活化

背景熒光增高也可能由于代謝活化引起。例如在PMA活化的PBMC中染IL-17A時(shí),從FMO對照中明顯看出BV421™通道基線(xiàn)的上升,這可能由多個(gè)因素引起,包括自發(fā)熒光增高和其它熒光素的滲漏增大引起。

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5、花青素染料

花青素染料和一些相關(guān)串聯(lián)染料很容易結合到Fc受體,尤其是單核細胞。這種反應無(wú)法通過(guò)Fc受體阻斷劑阻斷,其確切原因未知。如果你在研究髓系細胞中的一個(gè)群體,建議還是用其它類(lèi)別的熒光素。

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6、細胞碎片

你有沒(méi)有用活性染料來(lái)確保分析時(shí)都能分析到活細胞?細胞碎片、死細胞可導致高背景染色,所以在設門(mén)時(shí),切記要排除掉碎片。一般情況下,碎片在FSC/SSC散點(diǎn)圖中位于最左下方(如下圖)。

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7、活性

如果分析時(shí)不小心設門(mén)將死細胞/碎片圈進(jìn)了,就可能會(huì )出現一些假陽(yáng)性。所以用PI或7-AAD甚至一些更好的活性染料,能夠很好的排除死細胞(關(guān)于活性染料,我們之前發(fā)過(guò)一篇相關(guān)文章:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4124-1-1.html)。

DAPI也可以用來(lái)區分死/活細胞,它也能夠透過(guò)活細胞膜,但效率很低。下圖顯示了DAPI+細胞群和DAPI-細胞群之間CD45/CD11b散點(diǎn)圖的區別。

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8、Fc阻斷

Fc受體表達在很多細胞表面,包括粒細胞、B細胞、巨噬細胞和樹(shù)突狀細胞。它們很容易結合抗體的Fc部分,從而導致結果假陽(yáng)性。為了這種背景熒光,推薦使用商品化的Fc受體阻斷劑或相應物種的血清。

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9、FMO/同型對照

同型對照是為了幫助確定目的抗體非特異性背景染色(針對Fc受體或胞內蛋白結合)而設置的陰性對照。FMO(熒光扣從對照)相對來(lái)說(shuō)在抗原表達弱、或者進(jìn)行多色流式實(shí)驗的時(shí)候更適合,它可以反映你的抗體組合中其它通道熒光的滲漏,幫助你選擇正確的陽(yáng)性群體。

如果你要使用同型對照,記得一定要選擇與目的抗體相同量的同型抗體。例如你使用1ug CD4,那么就要使用1ug同型對照。

 

避免從不同公司購買(mǎi)同型和目的抗體,因為不同的公司,其抗體熒光素:蛋白(F:P)比例是不同的。

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10、粘連體

粘連體通常發(fā)生在細胞之間粘附在一起或分裂過(guò)程中。粘連體給流式細胞術(shù)分析帶來(lái)了困難,因為粘連體通過(guò)檢測點(diǎn)時(shí),檢測裝置仍然認為它是一個(gè)信號。所以如果沒(méi)有在分析時(shí)設門(mén)排除掉粘連體,那么就可能對結果造成誤讀。

在流式緩沖液中加入EDTA,并且將標本通過(guò)30um過(guò)濾,可以使粘連體大大減少。

粘連體還可以通過(guò)散點(diǎn)圖的W/H或W/A設門(mén)排除。如下圖,(1)代表單個(gè)細胞群,(2)代表粘連體,兩種群體的結果明顯不同。

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11、串聯(lián)染料降解

如果你使用的是串聯(lián)染料,那么如果抗體保存不當或者沒(méi)有避光,那么就可能發(fā)生降解。在下圖的例子中,左圖是正常的PE-cy5檢測結果,可以看到FL2沒(méi)有信號,但PE-cy5染料在光照后降解,右側圖就可以明顯看到FL2(PE通道)也能檢測到很強的信號。

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串聯(lián)染料對某些固定方式也很敏感,所以如果在固定后檢測發(fā)現背景熒光異常,那時(shí)也需要考慮是否由于固定劑引起。